Daniela KLIMOVÁ 1, Jakub STYK 1, Simona HUMPLÍKOVÁ 2, Petra PRIŠČÁKOVÁ 1, Vanda REPISKÁ 1

1 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky  LF UK a UNB, Bratislava, prednosta doc. MUDr. D. Bõhmer, PhD.
2 I. klinika anestéziológie a intenzívnej medicíny LF UK a UNB, Bratislava, prednosta MUDr. J. Koutun, CSc.

SÚHRN
Ochorenie Covid-19 sa šíri rýchlo a počet nakazených ľudí stúpa vo viac ako 100 krajinách sveta. Koronavírus SARS-CoV-2 infikoval k dnešnému dňu celkovo 169 714 ľudí, z čoho je hlásených 6 518 mŕtvych (16. 3. 2020). V regiónoch s kvalitnou zdravotnou starostlivosťou je pravdepodobnosť vyliečenia veľmi vysoká. Celkovo bolo vyliečených už 77 776 ľudí a v 80 % prípadoch je priebeh ochorenia mierny, bez potreby špeciálnych lekárskych opatrení. Miera úmrtnosti bola vypočítaná na 3,4 % vrátane Číny, bez jej zarátania je to iba 0,9 %. Sekvenačné analýzy potvrdzujú vysokú zhodu genómu

SARS-Cov-2 s genómom vírusu infikujúceho netopiere, ktoré sú pre koronavírusy prirodzeným hostiteľom. Patogenéza ochorenia stále nie je úplne objasnená, no spolupráca vedcov z celého sveta vedie k rapídnemu hromadeniu potrebných analytických dát. K dnešnému dňu zatiaľ neexistuje vakcína ani špecifická antivírusová liečba. Na diagnostiku sú k dispozícii skríningové testy, založené na metodike real-time kvantitatívnej PCR a NextGen sekvenovania. V predloženej práci sú zhrnuté najaktuálnejšie poznatky o incidencii, mortalite, genóme a diagnostike SARS-CoV-2.
Kľúčové slová: COVID-19, koronavírus, SARS-CoV-2, Spike proteín.
Lek obz, 69, 2020, č. 4, s. 102 – 106

Úvod

V decembri 2019 bolo v čínskom meste Wuhan hlásené ochorenie spôsobené novým typom β-koronavírusu SARS-CoV-2, o ktorom sú dosiaľ limitované znalosti, hlavne v oblasti patogenézy. Ochorenie dostalo názov COVID-19 (Coronavirus disease 2019) a spôsobuje infekciu respiračného systému, od miernych príznakov až po respiračné zlyhanie a smrť. Aktuálne (do 16. 3. 2020) bolo registrovaných 169 714 prípadov nakazených ľudí a 6 518 úmrtí (Centrum pre vedu a techniku spoločnosti Johns Hopkins (1)). Veľká väčšina prípadov je z pevninskej časti Číny (v provincii Wuhan), ale nákaza sa už rozšírila do viac ako 100 krajín sveta. COVID-19 predstavuje celosvetový problém najmä preto, že vypuknutie nákazy sa časovo zhoduje s priebehom čínskeho jarného festivalu, počas ktorého cestovalo Čínou stovky miliónov ľudí. Aktuálne je hlásených 85 425 aktívne nakazených pacientov z čoho 5 921 pacientov je vo vážnom stave (2). Podiel ťažko chorých pacientov z celkového počtu nakazených predstavuje momentálne 7 %. Za vyliečeného pacienta je považovaný ten, ktorý má 2 nezávisle po sebe realizované negatívne výsledky PCR testu na prítomnosť vírusu vo vzorke z tampónu (nos, nazofaryng, spútum), 10 dní nevykazuje prítomnosť horúčky a má zlepšený nález na röntgenovej snímke hrudníka. Aktuálne je registrovaných 77 776 prípadov vyliečených pacientov. Na základe medzinárodných hlásení výskytu ochorenia je odhadovaná reprodukcia vírusu každých 7 dní dvojnásobná. Miera úmrtnosti počítaná austrálskymi epidemiológmi je stanovená na 3,4 % (vrátane prípadov z Číny) (3). Tento údaj podľa mnohých odborníkov neodráža realitu z dôvodu veľkého množstva nenahlásených a/alebo nediagnostikovaných prípadov. Navyše, mnoho nakazených ľudí zomrelo doma a teda tieto prípady nikdy neboli nahlásené. Miera celosvetovej úmrtnosti bez započítania údajov Číny je nižšia, pohybuje sa okolo 0,9 %. Miera úmrtnosti kriticky závisí od kvality dostupnej lekárskej starostlivosti.

Genóm SARS-CoV-2 a jeho pôvod

Vírus typu SARS-CoV-2 patrí medzi β-koronavírusy s genómom jednovláknovej RNA pozitívnej polarity (29 829 bp). Študijná skupina Coronavirus (Coronavirus Study Group - CSG) medzinárodného výboru pre taxonómiu vírusov, ktorá je zodpovedná za oficiálnu klasifikáciu a taxonómiu vírusov rodiny Coronaviridae, vyhodnotila novosť ľudského patogénu predbežne označeného ako 2019-nCoV. Na základe taxonómie ho vedci z CSG formálne rozoznali ako sesterský typ koronavírusov závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoVs) druhu SARS-súvisiaceho koronavírusu a označuje ho ako SARS-CoV-2 (4). Vírusový genóm pozostáva zo 6 hlavných otvorených čítacích rámcov (Open Reading Frames - ORFs) spoločných pre všetky koronavírusy. Analýzy naznačujú, že 7 konzervovaných replikázových domén v ORF1b, ktoré sa používajú na klasifikáciu vírusov druhu CoV, sú na 94,6 % sekvenačne identické medzi 2019-nCoV a SARS-CoV, čo dokazuje zaradenie v rámci jedného druhu (5).
Ceraolo et al. (2020) porovnávali 54 celogenómových sekvencií 2019-nCoV od rôznych pacientov. Prekvapivo analýza potvrdila nízku variabilitu sekvenovaných vzoriek nového koronavírusu, čo naznačuje nedávny vstup vírusu do ľudskej populácie. Poukazuje na minimálne dve nukleotidové pozície s vyššou variabilitou v proteín-kódujúcich oblastiach a opísala divergencie špecifických aminokyselinových sekvencií medzi BCoV a SARS. Zhoda genómu SARS-CoV-2 s genómom SARS-CoV je približne 79 % a s MERS-CoV približne 50 %. Genóm 2019-nCoV obsahuje veľký gén kódujúci apolyproteín (ORF 1ab) na 5´ konci genómu, štyri hlavné gény kódujúce Spike proteíny (S), obalové proteíny (E), membránové glykoproteíny (M), nukleokapsidový proteín (N) a 6 prídavných otvorených čítacích rámcov (obr. 1) (6, 7).
Spike proteín je silne glykozylovaný, využíva N-terminálnu sekvenciu na vstup do endoplazmatického retikula a sprostredkovanie väzby k hostiteľským receptorom. V hostiteľskej bunke je S proteín štiepený proteázou podobnou furínu na dva samostatné S1 a S2 proteíny. N proteín sa viaže na RNA a je silne fosforylovaný. Tento proteín pravdepodobne napomáha viazať vírusový genóm na replikázovo-transkriptázový komplex a balí genóm do vírusových častíc. E proteín je transmembránový proteín s aktivitou iónových kanálov. Nie je potrebný pre replikáciu vírusu, ale pre patogenézu. M proteín je najviac zastúpený štrukturálny proteín. Neobsahuje signálnu sekvenciu a vo virióne sa nachádza v podobe diméru. Vyskytuje sa v dvoch rôznych konformáciách, ktorými umožňuje zakrivenie membrány a takisto sa viaže aj na nukleokapsid.
Od vypuknutia epidémie SARS pred 18 rokmi sa objavilo veľa typov koronavírusov v ich prirodzenom hostiteľovi – netopieroch (8, 9). Štúdie už v tom čase poukazovali na potenciálnu možnosť prenosu infekcie na ľudí (10, 11). Prenos z netopierov na ľudí pravdepodobne nastal mutáciou v Spike proteíne a momentálne sa prenáša z človeka na človeka prostredníctvom kvapôčkovej infekcie (s dosahom vydýchnutých vírusových častíc do 1,8 m) (12). Priemerná rýchlosť evolučného vývoja SARS-CoV-2 ako typického RNA vírusu, je zhruba 10-4 nukleotidových substitúcií za rok. V RNA vírusoch, ktorých genóm tvorí jednovláknová nukleová kyselina nedochádza k opravám nesprávne zaradených báz počas replikácie a tak mutácie vznikajú počas každého replikačného cyklu (13).
Identitu medzi netopierím koronavírusom a SARS-CoV-2 dokazujú výsledky analýz Zhou et al. (2020). Zistili, že krátka oblasť RdRp v genóme nietopierieho koronavírusu (BatCoV RaTG13), ktorú predtým detegovali u druhu netopiera Rhinolophus affinis v provincii Yunnan, vykazuje vysokú sekvenčnú identitu s 2019-nCoV. Po kompletnej sekvenačnej analýze RNA vzoriek vyhodnotili Simplot analýzou 96,2 % zhodu celogenómovej sekvencie (14). Vyššiu zhodu genómovej sekvencie mal 2019-nCoV s netopierími koronavírusmi bat-SL-CoVZC45 a bat-SL-CoVZXC21 ako s koronavírusom infikujúcim ľudí, ktorý spôsobil vypuknutie SARS v roku 2013. Gén kódujúci Spike proteín v 2019-nCoV mal najnižšiu sekvenačnú zhodu s bat-SL-CoVZC45 a bat-SL-CoVZXC21 (zhoda 75 %). Keďže mutácie vznikajú po každej replikácii je zaujímavé, že sekvencie 2019-nCoV od rôznych pacientov sú takmer totožné (zhoda 99,9 %) (15). Autori štúdie naznačujú, že 2019-nCoV pochádza z jedného zdroja vo veľmi krátkom časovom období a bol detegovaný relatívne rýchlo.
Výskumná skupina Wrapp et al. (2020) skonštruovala prvú 3D mapu Spike glykoproteínov z koronavírusu SARS-CoV-2 pomocou metódy Cryo-EM. Tieto proteíny sú zodpovedné za imunitnú odpoveď hostiteľa, a preto sú kľúčovým cieľom vakcín (16). Túto molekulu plánuje vedecký tím ďalej využívať ako próbu na izoláciu prirodzene produkovaných protilátok pacientov, ktorí boli infikovaní SARS-CoV-2 a úspešne sa vyliečili. V dosta­točnom množstve by tieto protilátky mohli pomôcť liečiť infekciu COVID-19 krátko po expozícii.
Receptor pre SARS-CoV-2 je angiotenzín-konvertujúci enzým 2 (ACE 2) (17). Väzba SARS-CoV-2 na ACE 2 spôsobuje zvýšenú expresiu ACE 2, čím spôsobuje poškodenie alveolárnych buniek, a tým vyvolá systémovú reakciu organizmu. Väzba vírusu typu SARS-CoV-2 na receptor je 10 až 20-krát silnejšia ako väzba receptora s vírusom typu SARS-CoV (14).

Diagnostické metódy na detekciu SARS-CoV-2

Na detekciu vírusov sa využívajú reverzne transkripčné  real-time kvantitatívne polymerázové reťazové reakcie (RT-qPCR) (18). Vedecko-lekárska komunita sa snaží vytvoriť súbor rýchlych a spoľahlivých molekulárno-diagnostických testov na diagnostiku SARS-CoV-2. Niekoľko medzinárodných skupín spoločne pracuje na základe zdieľaných sekvenčných údajov s cieľom navrhnúť primery pre testy metódou PCR. Laboratórium Dr. Drostena v Berlíne v spolupráci akademickými spolupracovníkmi v Európe a v Hong Kongu zverejnili 23. 1. 2020 podrobnosti o pracovnom postupe a diagnostickom teste kvantitatívnej
real-time PCR, ktorý deteguje SARS-CoV-2 a dokáže ho odlíšiť od SARS-CoV (19).
Medzičasom sa podarilo výskumnej skupine na Univerzite v Honkongu vyvinúť dva jednokrokové kvantitatívne RT-qPCR testy s próbou otvoreného čítacieho rámca ORF1b a N oblasti vírusového genómu. Testy boli validované pomocou dvoch klinických vzoriek získaných od pacientov infikovaných SARS-CoV-2. Ako skríningový test sa odporúča N-génový test a ako potvrdzujúci test sa odporúča test na ORF1b (20).
Od 15. 2. 2020 sú k dispozícii králičie protilátky Anti-SARS-CoV-2 Spike proti peptidu zodpovedajúcemu 20 aminokyselinám v blízkosti C-konca SARS-CoV-2 Spike glykoproteínu. Taktiež je dostupná protilátka Anti-SARS-Cov-2 Envelope voči peptidu z 10 aminokyselín v blízkosti N-konca SARS-CoV-2 E proteínu. Protilátky sú určené pre testovanie metódou ELISA (Enzyme-linked immunoabsorbent assay).

Klinický obraz

Príznaky infekcie sa môžu prejaviť do 2 až do 14 dní po expozícii a môžu zahŕňať typické chrípkové príznaky: horúčka, suchý kašeľ, upchatý nos, bolesti kĺbov a svalov, závraty a únava. Závažnosť symptómov sa môže pohybovať od veľmi miernej až po ťažkú formu respiračného zlyhania s nutnosťou hospitalizácie a intenzívnej starostlivosti, v niektorých prípadoch nastáva smrť. Väčšina závažných prípadov nakazených pacientov sú osoby vyššieho veku s komorbiditami (arteriálna hypertenzia, kardiovaskulárne choroby, diabetes mellitus, chronické pľúcne ochorenia) podobne ako v prípade chrípky (21). 17. 2. 2020 bol vydaný dokument čínskeho CDCC  (Chinese Center for Disease Control) v časopise Chinese Journal of Epidemiology. V dokumente epidemiológovia opisujú, že 80,9 % prípadov infekcie bolo mierneho typu s príznakmi podobnými chrípke, a pacienti boli liečení doma. 13,8 % prípadov boli závažné stavy spojené s pneumóniou. Kritických prípadov s respiračným zlyhaním, septickým šokom a multiorgánovým zlyhaním bolo 4,7 %. Približne v 2 % prípadov bola infekcia vírusom smrteľná. Medzi deťmi bolo zaznamenaných iba relatívne málo prípadov nakazených, s miernejším priebehom choroby a doposiaľ nezomrelo žiadne dieťa do veku 10 rokov (22, 23). Podľa informácií CDC nie sú dostupné dôkazy potvrdzujúce náchylnosť detí na infekciu COVID-19. Bolo hlásených len pár prípadov nákazy u detí, ktoré opisovali len mierne príznaky infekcie.

Prevencia

Momentálne nie je dostupná žiadna vakcína, WHO, CDC (Centers for Disease Control and Prevention) a Ministerstvo Zdravotníctva SR naďalej odporúčajú dodržiavať preventívne hygienické a epidemiologické opatrenia zníženia rizika infekcie (24).

Celosvetová štatistika výskytu

Údaje o potvrdených prípadoch infekcie koronavírusom a počet mŕtvych a vyliečených pacientov sú zosumarizované k dátumu 16.3.2020 v tabuľke 1 na základe dát od Johns Hopkins CSSE o globálnych prípadoch COVID-19.

Tabuľka 1. Potvrdené prípady výskytu COVID-19 podľa údajov aktualizovaných nemocnicou Johns Hopkins (16. 3. 2020).

Krajina/mesto    Počet potvrdených prípadov    Počet mŕtvych    Počet vyliečených

Miera úmrtnosti na COVID-19 sa líši v závislosti od vekovej skupiny. Riziko úmrtia pacientov konkrétnych vekových skupín sú zhrnuté v tabuľke 2.
Miera úmrtnosti na základe pohlavia je 2,8 % u mužov a 1,7 % u žien. Do úvahy sa ale musí zobrať aj fakt, že fajčenie je v Číne oveľa rozšírenejšie medzi mužmi.

Tabuľka 2. Miera úmrtnosti COVID-19 (počet úmrtí/počet prípadov = pravdepodobnosť úmrtia po infekcii vírusom v %) prepočítaná vzhľadom na vek pacienta. Údaje reprezentujú riziko úmrtia po nakazení SARS-CoV-2 (16. 3. 2020).

Záver

COVID-19 je infekčné ochorenie respiračného systému spôsobené novoobjaveným koronavírusom. Informácie o tomto type vírusu pred vypuknutím infekcie v čínskom Wuhane v decembri 2019 neboli všeobecne známe. Príznaky ochorenia sú väčšinou mierne, niektorí nakazení sú asymptomatickí, v  80 % prípadov sa pacienti zotavia bez potreby špeciálnej lekárskej starostlivosti. Starší pacienti s predchorobím majú vyššie riziko k ťažšiemu priebehu infekcie, u detí bolo detegovaných len veľmi málo prípadov s miernymi príznakmi. Napriek intenzívnemu výskumu k dnešnému dňu neexistuje vakcína ani špecifické antivirotikum, liečba je symptomatická. Dôležité je dodržiavanie protiepidemiologických a hygienických opatrení a najmä izolácia chorých.

* Vyhlásenie o ľudských právach: Tento článok neobsahuje žiadne štúdie na ľudských či zvieracích objektoch.
Konflikt záujmov: Daniela KLIMOVÁ, Jakub STYK, Simona HUMPLÍKOVÁ, Petra PRIŠČÁKOVÁ, Vanda REPISKÁ vyhlasujú, že nemajú žiaden konflikt záujmov.
Poďakovanie: Práca vznikla vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj pre projekt: Dobudovanie multidisciplinárneho centra pre biomedicínsky výskum – BIOMEDIRES, ITMS 26210120041, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Literatúra
    1.    https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 (cit. dňa 16.3.2020)
    2.    https://www.worldometers.info/coronavirus/ (cit. dňa 16.3.2020)
    3.    Pan American Health Organization / World Health Organization. Epidemiological Update: Novel Coronavirus (2019 nCoV). 27 January 2020, Washington, D.C.: PAHO/WHO; 2020
    4.    VELAVAN T.P., MEYER Ch.G.: The Covid-19 epidemic. Tropical medicine & international health: TM & IH, 2020.
    5.    CERAOLO C., GIORGI F.M.: Genomic variance of the 2019-nCoV coronavirus. Journal of Medical Virology, 2020.
    6.    ZHOU P. et al.: A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 2020, 1-4.
    7.    GORBALENYA A.E.: Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus–The species and its viruses, a statement of the Coronavirus Study Group. BioRxiv, 2020.
    8.    LI W. et al.: Bats are natural reservoirs of SARS-like coronaviruses. Science, 2005, 310.5748: 676-679.6 Yang, L. et al. Novel
SARS-like Betacoronaviruses in Bats, China, 2011. Emerg Infect Dis 19, 989-991, (2013).
    9.    MENACHERY V.D. et al.: A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med, 2015, 21, 1508-1513.
10.    MENACHERY V.D. et al.: SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, 113.11: 3048-3053.
11.    CHAN J.F.W. et al.: A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. The Lancet, 2020.
12.    https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/index.html (cit. dňa 16.3.2020)
13.    LU R. et al.: Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. The Lancet, 2020.
14.    ZHOU P. et al.: A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 2020, 1-4.
15.    SU S., WONG G., SHI W. et al.: Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends Microbiol, 2016, 24: 490–502.
16.    WRAPP D. et al.: Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 2020 doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.11.944462.
17.    ZHAO Y. et al.: Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. BioRxiv, 2020.
18.    GHELICHKHAN M. et al.: Establishment of reverse transcription polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of human parainfluenza virus types 1 to 4 in children with influenza like illnesses. Bratislava Medical Journal, 2017, 118.12: 772-776.
19.    CORMAN V.M. et al.: Detection of 2019 novel coronavirus
(2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance, 2020, 25.3.
20.    CHU D.K.W. et al.: Molecular diagnosis of a novel coronavirus (2019-nCoV) causing an outbreak of pneumonia. Clinical chemistry, 2020.
21.    https://www.who.int/health-topics/coronavirus (cit. dňa 16.3.2020)
22.    JIN H. et al.: Novel coronavirus pneumonia emergency in Zhuhai: impact and challenges. Journal of Hospital Infection, 2020.
23.    LI Q. et al.: Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus–infected pneumonia. New England Journal of Medicine, 2020.
24.    LIPTAKOVA A., DUBINOVA M.: Koronavírusy – máme sa ich báť? Lek Obz, 69, 2020, č. 3, s. 4-6.

Do redakcie došlo 31.2.2020 (článok bol aktualizovaný 16.3.2020)

Adresa pre korešpondenciu:
Mgr. Daniela Klimová
Ústav lekárskej biológie, genetiky a lekárskej genetiky LF UK a UNB
Sasinkova 4
811 08 Bratislava
E-mail: Táto e-mailová adresa je chránená pred spamovacími robotmi. Na jej zobrazenie potrebujete mať nainštalovaný JavaScript.