Súhrn
Východisko: Creutzfeldtova-Jakobova choroba (CJch) je naj častejšia zo skupiny humánnych transmisívnych spongioformných encefalopatií (TSE). V celosvetovom meradle až 85 % prípadov CJch má sporadický výskyt a 15 % je genetického pôvodu. Na Slovensku patrí ku genetickej forme s mutáciou prionového génu E200K až 74,2 % všetkých prípadov choroby. Vyšetrenie fibríl asociovaných so scrapie (scrapie associated fibrils, SAF) elektrónovým mikroskopom je špecifický diagnostický test pre TSE a pozitívny výsledok nevyžaduje potvrdenie. Kým výsledky detekcie SAF sú pri sporadickej CJch známe, genetické prípady CJch, pre ich zriedkavosť, neboli doteraz vyšetrované. Cieľom práce je semikvantitatívne vyhodnotiť význam tejto metódy v diagnostike CJch a porovnať nálezy SAF v genetických a sporadických prípadoch Creutzfeldtovej-Jakobovej choroby.
Súbor a metódy: Excízie mozgu (niektoré doručené z patológií v autolyzovanom stave) zo 40 suspektných prípadov CJch boli uskladnené pri -80 oC až do spracovania. Z každej vzorky bol odobratý cca 1 g sivej hmoty, ktorý bol homogenizovaný v 10 až 12 ml roztoku sarkozinátu sodného v 0,1M Tris HCl pufri pH 7,4 s následnou sonifikáciou. Suspenziu sme koncentrovali pri 40 000 otáčkach ultracentrifúgou Beckman L8 s rotorom SW60 a pelet bol vystavený tráviacemu účinku proteázy K 2 hodiny. Po premytí peletu v 0,1M Tris pufri sme ho nanášali na medené sieťky, fixovali 5% glutaraldehydom a negatívne kontrastovali 3% fosfowolfrámo vou kyselinou. Sieťky sme prezerali v elektrónovom mikroskope. Pozitívny nález sme odfotografovali a neoznačené fotografie boli dvomi pracovníkmi nezávisle hodnotené jedným až tromi krížikmi. Posudzovala sa 1. prítomnosť charakteristických SAF (pozitivita testu) a 2. usporiadanie a hustota výskytu fibríl. Výsledky sa porovnávali v závislosti od CJch-špecifickej mutácie E200K a polymorfizmu M129V prionového génu.
Výsledky: Zo 40 vyšetrených vzoriek boli v 33 (z toho vo dvoch autolyzovaných) SAF prítomné (výsledok pozitívny). Väčší počet a zhluky fibríl v jednom obraze (výsledok +++) sa častejšie vyskytli pri sporadickej forme (26,6 %) v porovnaní s genetickou CJch (22,2 %). Niekoľko ojedinelých fibríl alebo malé skupinky (výsledok ++) boli prítomné u 46,6 % sporadických a 33,3 % genetických pacientov. Najmenší výskyt fibríl (+) sa našiel v 26,6 % sporadických a 44,4 % genetických prípadoch Creutzfeldtovej-Jakobovej choroby. Prevaha väčšieho počtu SAF pri sporadickej forme CJch bola výraznejšia v podskupine homozygo tov s metionínom na kodóne 129 prionového génu.
Závery: Detekcia SAF pomocou elektrónového mikroskopu je spoľahlivá špecifická metóda diagnostiky pri sporadickej aj genetickej forme CJch vrátane vzoriek autolyzovaných, ktoré sa nedajú použiť na neurohistologické vyšetrenie. Pri porovnaní sporadickej s genetickou formou CJch, ktorú charakterizuje mutácia prionového génu E200K, je výskyt SAF (počet jednotlivých fibríl a ich zoskupení) vyšší pri sporadickej forme. Rozdiel je výraznejší u pacientov, ktorí na oboch alelách prionového génu majú na kodóne 129 metionín.
Kľúčové slová: Creutzfeldtova-Jakobova choroba – transmisívne spongioformné encefalopatie – fibrily asociované so scrapie – prion.
Summary
Introduction: Creutzfeldt-Jacob disease (CJD) is the most frequent among the group of human transmissive spongioform encephalopathies (TSE). As many as 85 % of CJD have sporadic incidence in worldwide scale and 15 % are of genetic origin. In Slovakia 74.2 % of all cases of CJD belong among genetic form with the E200K mutation of the prion gene. The examination of scrapie associated fibrils (SAF) by electrone microscope is a specific diagnostic test for TSE whose positive result does not require any confirmation test. While the results of SAF detection in sporadic CJD are known, genetic cases of Creutzfeldt-Jakob disease have not yet been studied due to their scarcity. The aim of this paper is to make a semiquantitative evaluation of the significance of this method in the diagnostics of CJD and to compare the SAF findings in genetic and sporadic cases of CJD.
Patients and methods: Brain samples some of them sent from pathology in autolyzed state) from 40 suspected cases of Creutzfeldt-Jacob disease were stored at -80 °C until the time of processing. Approximately one gram of grey matter was taken from each brain sample and was homogenized in 10 – 12 ml of sodium sarcosinate solution in 0.1M Tris HCI buffer pH 7.4 with subsequent sonification. The suspension was concentrated by ultracentrifugation (40 000 revolution Beckman L8 ultracentrifuge with rotor SW60) and the pellet was exposed to the digestive effect of protease K for 2 hours. After washing up of the pellet in 0.1M Tris buffer it was applied to the copper girdmesh, fixed with 5 % glutaraldehyde and negatively contrasted by 3 % phosphoricwolfram acid. The samples were examined by electrone microscope. Positive finding was photographed. Two different workers anonymously evaluated the photographs by one, two or three crosses. We assessed 1.the presence of characteristic SAF structure (positive test) and 2.the arrangement and prevalence of the fibrils. The results were analyzed in correlation with CJD specific mutation E200K and M129V prion gene polymorphism.
Results: Out of 40 examined samples SAF was present in 33 (of which 2 in autolyzed sample) (positive result). A large number of fibril clusters in one (result +++) was detected more frequently in sporadic form (26.6 %) in contrast with genetic CJD (22.2 %). Several fibrils of small groups (result ++) were present in 46.6 % of sporadic and 33.3 % of genetic patients. The smallest incidence of fibrils (+) was revealed in 26.6 % of sporadic and 44.4 % of genetic cases of CJD. The prevalence of a large number of SAF in sporadic CJD was more significant in the subgroup of methionine/methionine homozygotes on codon 129 of the prion gene.
Conclusions: Detection of SAF by electrone microscopy is a reliable specific diagnostic method in sporadic and genetic forms of CJD including autolyzed samples which cannot be used for neurohistological examination. When comparing sporadic and genetic form of CJD characterized by E200K prion gene mutation, the SAF prevalence (number of individual fibrils and their arrangements) is higher in the sporadic form. The difference is more pronounced in patients who have 129 methionine on both alleles of the prion gene on codon 129.
Key words: Creutzfeldt-Jakob disease – transmissive spongioform encephalopathies – scrapie associated filbrils – prion – electrone microscope
Comparison of scrapie associated fibrils in genetic and sporadic forms of Creutzfeldt-Jakob disease
Girma Belay a Eva Mitrová
(Z Národného referenčného centra prionových chorôb, Vedecko-výskumná základňa Slovenskej zdravotníckej univerzity, riaditeľ MUDr. Ján Kazár, DrSc.)
