• Marta Babálová, Jana Blahová, Petr Ježek, Kvetoslava Králiková, Vladimír Krčméry, Radko Menkyna
• Prenosná rezistencia na antibiotiká a fluoro­chino­lóny v multirezistentných kmeňoch E. coli a Klebsiella pneumoniae z oddelení veľkej oblastnej nemocnice
• Lek Obz, 59, 2010, č. 10, s. 383 – 386.

Súhrn

Východisko: Skúmala sa prenosnosť rezistencie na antibiotiká v piatich multirezistentných kmeňoch (troch kmeňov E. coli a dvoch kmeňov K. pneumoniae) od pacientov hospitalizovaných na rôznych oddeleniach oblastnej nemocnice. Zisťovala a porovnávala sa štruktúra determinantov rezistencie prenesených na recipientný kmeň E. coli K-12.

Materiál a metodika: Transfer rezistencie sa zisťoval v zmiešanej kultúre každého darcovského kmeňa s kultúrou recipientného kmeňa. Po inkubácii boli tieto zmiešané kultúry naočkované na bi-antibiotické pôdy, ktoré obsahovali rifampicín, na ktorý bol rezistentný recipientný kmeň, plus ďalšie antibiotikum v spektre každého darcovského kmeňa. Získané transkonjugantné kolónie sa analyzovali metódou nepriamej selekcie na prítomnosť všetkých ďalších prenesených rezistencií.

Výsledky: Zistilo sa, že každý z piatich darcovských kme­ňov prenášal na recipientný kmeň rôzne determinanty rezistencie. Transferabilnosť rezistencie v skúmaných kmeňoch nebola bloková, ale výrazne individuálna. Jeden darcovský kmeň prenášal aj rezistenciu na fluoro­chino­lóny.

Záver: Transfer rezistencie z piatich skúmaných multirezistetných kmeňov bol individuálny. Nenastal teda výskyt a prenos totožných blokov rezistencie v kmeňoch z rôznych klinických pracovísk a šírenie sa jedného R-plazmidu medzi baktériami. Pripisuje sa to dodržiavaniu hygienického režimu na uvedených pracoviskách.

Kľúčové slová: prenos rezistencie na antibiotiká – štruktúra rôznych R-plazmidov – prenesené gény rezistencie – metóda nepriamej selekcie.

Lek Obz, 59, 2010, č. 10, s. 383 – 386.

Transferable resistance to antibiotics and fluoroquinolones in strains of E. coli and K. pneumoniae from patients of a large regional hospital

Summary

Background: We investigated the transferability of determinants of resistance to antibiotics in five bacterial strains (three strains of E. coli and two strains of K. pneumoniae) isolated from different patients hospitalized in various departments of a large Regional hospital. The structure of genetic determinants of resistance transferred from each strain to a recipient strain of E. coli K-12 was analyzed to obtain results whether different R plasmids were transferred from each donor multiresistant strain.

Material and methods: The transfer of resistance was demonstrated in mixed cultures of each donor multiresistant strain with the recipient strain of E. coli K-12. The mixtures were then inoculated on bi-antibiotic media which contained rifampicin (to which the recipient was resistant) plus a single drug present in the spectrums of each donor strain. Obtained transconjugant colonies were then analyzed, by the procedure of indirect selection, for the presence of all resistance determinants transferred.

Results: Each donor strain investigated transferred individual and different spectrum of determinants of resistance. One donor strain transferred also the resistance to fluoroquinolones.

Conclusions: The structure of R plasmids transferred from five strains isolated from patients hospitalized in different clinical settings of the hospital was individual and mutually different. We did not observe a transfer of a single plasmid among bacterial strains in different patients which might be ascribed to the satisfactory hygienic regime in the clinic studied.

Key words: transfer of antibiotic resistance – the structure of R plasmids – indirect selection method – comparison of R plasmids.

Lek Obz, 59, 2010, 10, p. 383 – 386.

Úvod

V našej predchádzajúcej práci (1) sme uviedli výsledky štúdia prenosnej rezistencie na antibiotiká a fluorochinolóny v dvoch kmeňoch Klebsiella pneumo­niae izolovaných od pacientov v rôznych intenzívnych jednotkách veľkej fakultnej nemocnice. Štruktúra prenesenej rezistencie z obidvoch kmeňov bola veľmi podobná, čo naznačuje rozšírenie sa jedného totožné­ho R-plazmidu na obidva kmene. Každý z týchto kmeňov sa môže stať potenciálnym zdrojom prenosnej rezistencie na antibiotiká na ďalšie kmene, ktorá sa šíri najmä pri nedostatkoch v dodržiavaní zásad nemocnič­nej hygieny a preventívnej medicíny (3, 4, 6, 8).

V predloženej práci uvádzame výsledky štúdia pre­nosnej rezistencie v piatich nozokomiálnych kmeňoch baktérií izolovaných od vážne chorých pacientov hospitalizovaných na rôznych pracoviskách intenzívnej medicíny Oblastnej nemocnice v Příbrame. Transfery rezistencie tu však boli, na rozdiel od baktérií z pred­chádzajúcej štúdie vo veľkej fakultnej nemocnici (1), značne individuálne a dokumentujú okolnosť, že zrejme vzhľadom na dôraz kladený na dodržiavanie zásad nemocničnej hygieny (3, 4) nedochádza tu k rozširova­niu určitého totožného R-plazmidu, prípadne totožného nozokomiálneho kmeňa baktérií. Spektrá a modusy transferu rezistencie zostávajú pri kmeňoch baktérií od pacientov v rôznych oddeleniach individuálne. Za dôležitú negatívnu okolnosť pokladáme však zistenie, že v niektorých nami vyšetrovaných kmeňoch sa zistila, a to metódou nepriamej selekcie, aj prenosná rezisten­cia na fluorochinolónové chemoterapeutiká.

Materiál a metódy

Prenosnú rezistenciu na antibiotiká sme zisťovali v piatich kmeňoch nozokomiálnych baktérií izolovaných od pacientov s bakteriémiou a klinickou sepsou, hospitalizovaných na rôznych pracoviskách intenzívnej starostlivosti Oblastnej nemocnice v Příbrame. Pôvod troch kmeňov E. coli a dvoch kmeňov Klebsiella pnumoniae, spektrá ich rezistencie a výsledky transferov a ich analýz uvádzame v tabuľke 1 a 2.

Zisťovanie a analýzy prenosnej rezistencie uvede­ných kmeňov sme vykonávali metódou zmiešaných kultúr uvedených kmeňov – darcov rezistencie s kul­túrou recipientného kmeňa, uvedenou v našej predchá­dzajúcej práci (1, 2). Ako recipientný kmeň sme opäť použili kmeň E. coli K-12 No. 3110rif+ rezistentný na 200 mg.L-1 rifampicínu a pri overovaní niektorých výsledkov aj ďalší recipientný kmeň P. mirabilis P-38rif+. Tieto kmene nám poskytol profesor S. Mitsuhashi, University of Maebashi, Japonsko.

Transkonjugantné kolónie E. coli K-12 3110rif+R+, v ktorých sa zistil prenos rezistencie na určité jedno antibiotikum, sme vyšetrili na prítomnosť aj ďalších pre­nesených determinantov rezistencie metódou nepria­mej selekcie.

Výsledky

1. Prenosná rezistencia v multirezistentných kmeňoch E. coli

Od troch pacientov z rôznych oddelení veľkej oblastnej nemocnice sme izolovali v 2. polroku 2009 kmene E. coli s výraznou, ale odlišnou a individuálnou zostavou mnohopočetnej rezistencie na jednotlivé antibiotiká (tab. 1). Kmeň č. 27/190 bol rezistentný na tikarcilín, kanamycín a cefalotín, zatiaľ čo kmene č. 29/727 a 30/662 sú na kanamycín citlivé. Kmene č. 27 a 29 sú rezistentné aj na fluorochinolóny (ofloxacín) a aztreonám, zatiaľ čo kmeň č. 30 je na tieto antibiotiká citlivý. Kmene č. 27 a 30 sú rezistentné aj na cefoperazón (zaraďovaný už do tzv. 4. generácie cefalosporínov), avšak kmeň č. 29 je na toto antibioti­kum citlivý. Z cefalosporínov zaraďovaných do 3. ge­nerácie sú všetky tri skúmané kmene rezistentné na ceftazidim, ale súčasne nezvyčajne citlivé na cefotaxim. Tieto tri kmene teda nemôžeme zaradiť, tak ako skúmané kmene Klebsiella pneumoniae, medzi kmene nesúce gén(y) pre tzv. ESBL (Extended Spectrum Beta-Lactamase).

Prenášané gény rezistencie z týchto troch kmeňov na recipientný kmeň E. coli K-12 No. 3110 rif+ sú v týchto jednotlivých skúmaných kmeňoch takisto odlišné (tab. 1). Všetky tri kmene prenášajú rezistenciu na tikarcilín, cefalotín a ceftazidim. Kmeň č. 27 prenáša aj rezistenciu na kanamycín a kmene č. 27 a 29 aj na aztreonám. Pritom kmeň č. 30 prenáša rezistenciu aj na cefaperazón, čo sa potvrdilo aj použitím ďalšieho recipientného kmeňa P. mirabilis P-38 rif+.

Zisťovanie celého spektra prenesených génov rezistencie sa vykonávalo metódou nepriamej selekcie. Transkonjugantné kolónie E. coli K-12 No.3110 rif+R+ (teda kolónie recipientného kmeňa E. coli K-12, ktoré prijali gén(y) rezistencie na určité antibiotikum a narástli na bi-antibiotických pôdach obsahujúcich selektujúce antibiotikum rifampicín plus jedno z antibiotík prítom­ných v spektre rezistencie darcovského kmeňa) sa vyšetrovali na rezistenciu aj na ďalšie, priamo neselektujúce antibiotiká (tab. 1). Zistilo sa, že niektoré transkonjugantné kolónie získané po transfere z kmeňa č. 27 boli rezistentné nielen na celé spektrum prenese­nej rezistencie, ale aj na cefoperazón (ktorého transfer sa nedokázal v pokuse priameho prenosu).

Transkonjugantné kolónie získané transferom z kme­ňa č. 29 boli, naopak, jednotne rezistentné na štyri antibiotiká (tikarcilín, cefalotín, ceftazidim, aztreonám) bez ohľadu na to, na ktorom antibiotiku (plus rifampi­cín) boli selektované.

Z kmeňa č. 30 sa prenášali na obidva nami použité recipientné kmene (E. coli K-12 3110 a pre kontrolu aj kmeň P. mirabilis P-38) totožné štyri determinanty rezistencie vrátane rezistencie na cefoperazón – cefa­-l­osporín zaraďovaný už medzi cefalosporíny 4. generá­cie. Na rozdiel od dvoch kmeňov, č. 27 a 29, sa v tomto kmeni rezistencia na aztreonam nedokázala.

Na záver možno zdôrazniť, že podrobná genetická analýza transferov a ich produktov vo všetkých troch nami skúmaných multirezistentných kmeňoch E. coli zistila nielen odlišnosti ich spektier rezistencie, ale aj ich odlišné správanie sa pri odovzdávaní jednotlivých determinantov rezistencie recipientným kmeňom. Ukazuje sa teda, že pri troch rôznych nozokomiálnych kmeňoch od pacientov z rôznych klinických oddelení sa vyskytuje individuálna a odlišná štruktúra deter­mi­nantov rezistencie a prenosnej rezistencie. Nerozširuje sa teda jeden nozokomiálny kmeň, ale existujú via­ceré možné zdroje prenosu rezistencie na rôzne antibiotiká.

2. Prenosná rezistencia v multirezistentných kmeňoch Klebsiella pneumoniae

Od dvoch pacientov hospitalizovaných v rôznych oddeleniach tej istej oblastnej nemocnice sa izolovali dva kmene K. pneumoniae s výraznou a značne odliš­nou multirezistenciou (tab. 2). Kmene boli rezistentné na tikarcilín, kanamycín a cefalotín, ako aj na cefalo­sporíny 3. generácie (cefotaxim a ceftazidim) a 4. gene­rácie (cefoperazón a cefepim). Prenosná rezistencia na cefotaxim a ceftazidim (na recipientný kmeň E. coli K-12 No. 3110 rif+) naznačuje v darcovských kmeňoch K. pneumoniae prítomnosť prenosného génu pre beta-laktamázu s rozšíreným spektrom účinnej hydrolýzy početných betalaktámových antibiotík, označovanú ako ESBL (Extended Spectrum Beta-Lactamase). Navyše obidva kmene boli rezistentné na aztreonám, a kmeň č. 31 bol ako jediný rezistentný aj na fluorochinolóny (ofloxacín).

Pri skúmaní transferu rezistencie sa pri obidvoch týchto darcovských kmeňoch K. pneumoniae opäť ukázali výrazné rozdiely. Kmeň č. 31 transferoval priamo na E. coli K-12 3110 rif+ iba a jedine determinant rezistencie na cefalotín. Tieto transkonjuganty E. coli K-12 No. 3110 rif+CLO+ boli však rezistentné aj na všetky antibiotiká, na ktoré bol darcovský kmeň K. pneumoniae č. 31 rezistentný - teda na cefalotín, kanamycín, treťo- a štvrto-generačné cefalosporíny, na aztreonám ako aj na ofloxacín. Uvedený darcovský kmeň K. pneumoniae č. 31 teda transferuje aj rezistenciu na fluorochinolón, ktorá sa, ako vidieť, exprimuje v mikróbnych bunkách až pri ďalších replikáciách.

Pri skúmaní priameho transferu génov rezistencie z kmeňa K. pneumoniae č. 32 (tab. 2) sa ukázalo, že tento darcovský kmeň priamo prenášal na E. coli K-12 3110 rif+ široké spektrum génov rezistencie. Neprenáša však rezistenciu na kanamycín, cefalosporíny 4. gene­rácie (cefoperazón a cefepim) a na fluorochinolóny, ktorých prenos sa nepreukázal ani pri analýze trans­konjugantných klonov E. coli rif+R+. Pri analýze týchto transkonjugantov sa ukázalo, že sa do recipientného kmeňa E. coli K-12 No. 3110 rif+ preniesli aj gény kódujúce rezistenciu na cefoperazón alebo cefepim, ktorých transfer sa pri priamych pokusoch ne­preukázal.

Diskusia

Spolu sme vyšetrili transfery génov rezistencie na antibiotiká z piatich multirezistentných kmeňov (troch kmeňov E. coli a dvoch K. pneumoniae) izolovaných od jednotlivých pacientov z rôznych klinických pracovísk veľkej oblastnej nemocnice. Pri priamych transferoch sa z každého kmeňa prenášala odlišná výbava génov re­zistencie. Táto odlišnosť spektier prenesenej rezistencie sa ešte väčšmi potvrdila pri analýze celého spektra prenesenej rezistencie metódou nepriamej selekcie, teda analýzou jednotlivých klonov recipientného kmeňa E. coli K-12 3110 rif+ izolovaných na pôdach obsahujú­cich rifampicín plus jedno z antibiotík v spektre darcovského kmeňa.

V súbore nami skúmaných kmeňov teda nenastalo rozšírenie jedného nozokomiálneho multirezistentného kmeňa s totožnou prenosnou rezistenciou na rôznych pacientov ani rozšírenie sa jedného prenosného R- plazmidu. Taký kmeň, ako aj určitý plazmid by sa šírili a prenášali na pacientov pri nedostatočnom zabezpečení zásad nemocničnej hygieny a preventívnej medicíny, čo zrejme nenastáva v oddeleniach tejto nemocnice. Výsledky predloženej štúdie prenosnej rezistencie ukázali, že prvým a najdôležitejším predpokladom zachovania dobrej účinnosti celej palety účinných antibiotík vyšších generácií je okrem racionál­nej antibiotickej politiky všeobecne dodržiavaný vysoký štandard aplikácie zásad nemocničnej hygieny.

Pri rozsiahlej analýze štruktúry génov prenesenej rezistencie sa v jednom kmeni Klebsiella pneumoniae opäť potvrdila, tak ako v predchádzajúcej štúdii (1), prenosnosť rezistencie na fluorochinolónové chemo­terapeutiká, konkrétne na ofloxacín. Prenos rezistencie na tieto potrebné a často užívané chemoterapeutiká môže aj u ambulantných pacientov už v blízkej bu­dúcnosti ohroziť dosiaľ dobrú účinnosť týchto substan­cií (5, 7, 9).

Záver

Skúmala sa prenosnosť rezistencie na antibiotiká z piatich multirezistentných kmeňov (3 kmene E. coli a 2 kmene K. pneumoniae) od pacientov hospitalizo­vaných v rôznych jednotkách intenzívnej terapie veľkej oblastnej nemocnice. Spektrá mnohopočetnej rezistencie uvedených kmeňov baktérií boli rozmanité a zahrnovali v niektorých prípadoch rezistenciu na rôzne cefalospo­ríny 3. a 4. generácie, na aztreonám a v niektorých kmeňoch aj na fluorochinolónové chemoterapeutiká.

Pri transfere génov rezistencie na recipientný kmeň E. coli K-12 sa opäť prenášali determinanty rezistencie na rozmanité antibiotiká. Táto rozmanitosť sa potvrdila pri každom skúmanom kmeni aj analýzou obsahu génov prenesenej rezistencie v transkonjugantných klonoch recipienta po transfere z každého z piatich darcovských (donorových) kmeňov. Nenastalo teda šírenie sa totožných mikróbových kmeňov na rôznych pacientov jednotlivých lôžkových zariadení ani šírenie totožných R-plazmidov, čo môže byť dôsledkom dodržiavania preventívnych opatrení v rámci nemocničnej hygieny. V jednom darcovskom kmeni sa metódou nepriamej selekcie zistila prenosnosť rezistencie na fluoro­chino­lónové chemoterapeutiká.

Literatúra

1.    Babálová, M., Bartoníková, N., Blahová, J., Králiková, K., Krčméry, V., Menkyna, R., Rovný, I.: Mobilizácia k transferu rezistencie na fluorochinolóny z dvoch nozokomiálnych kmeňov Klebsiella pneumoniae. Lek Obz, 58, 2009, s. 288-290.
2.    Babálová, M., Blahová, J., Králiková, K., Krčméry, V., Kuboňová, K., Menkyna, R., Rovný, I.: Kmene Klebsiella pneumoniae z dvoch pracovísk intenzívnej starostlivosti fakultnej nemocnice obsahujú totožné gény prenosnej multirezistencie na antibiotiká. Lek Obz, 55, 2006, s. 96-98.
3.    Biffová, M.: Nozokomiální infekce v kontextu bezpečné chirurgie. Zdrav Noviny 58, 2009, s. 16.
4.    Frantálová, D.: Prevence nozokomiálních nákaz. Zdrav Noviny, 58, 2009, s. 9.
5.    Kumar, SM, Heirstraten, L. V, Lammens, C.: Emergence of high-level fluoroquinolone resistance in S. pyogenes, J Antimicrob Chemother, 63, 2009, s. 886-894.
6.    MacPherson, D.W., Gushulak, B.D., Baine, W.B.: Population mobility, globalization and antibiotic drug resistance. Emerg Infect Dis, 15, 2009, s. 1727-1732.
7.    Nazik, H.: Prevalence of qnrA among ESBL-positive and ciprofloxacin resistant isolates. J Chemother, 21, 2009, s. 219-221.
8.    Petr, J.: Genom stafylokoku ukazuje cestu nákazy. Zdrav Noviny, 59, 2010, s. 10.
9.    Rodriguez, J.M., Velasco, B.C., Conjeo, M.C.: Mutational analysis of quinolone resistance in plasmid-encoded pentapeptide repeats proteins Qnr. J Antimicrob Chemother, 63, 2009,
s. 1128-1134.

Marta Babálová, Jana Blahová, Petr Ježek, Kvetoslava Králiková, Vladimír Krčméry, Radko Menkyna