• Terapeutická angiogenéza v liečbe pacientov s kritickou končatinovou ischémiou
• Andrej KLEPANEC , Ivan VULEV, Martin MISTRÍK, Juraj MAĎARIČ
• Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 171 – 174.

SÚHRN

Kritická končatinová ischémia (KKI) je klinickou manifestáciou koncového štádia periférnej artériovej choroby dolných končatín. Progresívna ischémia vedie k rozvoju ischemických pokojových bolestí alebo kožných defektov. Včasné rozpoznanie, medikamentózna a revaskularizačná liečba sú štandardnou súčasťou starostlivosti o týchto pacientov, pričom až 40 % pacientov nemá nález vhodný na endovaskulárnu alebo chirurgickú liečbu. U zostávajúcich pacientov je často v krátkom čase neodvrátiteľná nevyhnutnosť amputácie spojená s vysokou mortalitou. V posledných dvoch dekádach sa rozvinuli nové terapeutické možnosti pomocou tzv. terapeutickej angiogenézy s cieľom podporiť neovaskularizáciu a rozvoj nového kolaterálneho cievneho riečiska. Úvodné štúdie u menších skupín pacientov s KKI zistili, že u pacientov, u ktorých endovaskulárna alebo chirurgická liečba nie je možná alebo zlyhala, môže mať indukcia terapeutickej angiogenézy pomocou transplantácie autológnych kmeňových buniek, či pomocou génovej terapie rastovými faktormi terapeutický účinok a môže slúžiť k záchrane končatiny. Tento prehľadový článok zhrňuje mechanizmy terapeutickej angiogenézy, jednotlivé možnosti a doterajšie výsledky bunkovej a génovej liečby a budúce perspektívy angiogénnej liečby u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou.

Kľúčové slová: kritická končatinová ischémia – terapeutická angiogenéza – kmeňové bunky – génová liečba.

• Therapeutic angiogenesis in the treatment of patients with critical limb ischemia
• Andrej KLEPANEC , Ivan VULEV, Martin MISTRÍK, Juraj MAĎARIČ
• Lek Obz, 60, 2011, 4, p. 171 – 174.

SUMMARY

Critical limb ischemia (CLI) is a clinical manifestation of end stage peripheral arterial obstructive disease of lower extremities. Progressive ischemia leads to development of ischemic rest pain or skin ulcers. Early recognition, medical therapy and revascularization are standard treatment strategies in these patients, however up to 40% of patients are not suitable for endovascular or surgical treatment. In remaining group of patients often amputation in short period of time is necessary, and it is associated with high mortality. In the last two decades the new therapeutic strategies called therapeutic angiogenesis have been developed with the aim of neovascularization promotion and new collaterals formation. Preliminary studies in small groups of CLI patients showed, that in patients with no option for endovascular or surgical revascularization or with failed revascularization, induction of therapeutic angiogenesis with autologous stem cells transplantation or with growth factors gene therapy can have therapeutic effect and can lead to limb salvage. This review article summarizes mechanisms of therapeutic angiogenesis, possibilities and current results of cell and gene therapy, and future perspectives of angiogenic therapy in patients with CLI.

Key words: critical limb ischemia – therapeutic angiogenesis – stem cells – gene therapy.

Úvod

Periférne artériové ochorenie končatín (PAO) má odhadovanú celkovú prevalenciu 3 – 10 %, u osôb starších ako 70 rokov sa zvyšuje na 15 – 20 % (14). V 4,3 – 9,6 % prípadov dochádza u pacientov s PAO k progresii do koncového štádia kritickej končatinovej ischémie (KKI), pričom pacienti v tomto štádiu choroby sú výrazne ohrození rizikom amputácie končatiny a majú kvalitu života porovnateľnú s pacientmi v terminálnych štádiách nádorových chorôb (1).

Amputácia a mortalita sú v prvom roku u pacientov s KKI približne 25 %, ale mortalita môže dosiahnuť až 45 % u tých pacientov, ktorí podstúpili amputáciu (9). Pre negatívny vplyv na kvalitu života a pre zlú prognózu pri prežívaní, ako aj pri strate končatiny, predstavuje KKI v súčasnosti celosvetový kritický medicínsky i spoločenský problém. Terapeutické možnosti pre pacientov s KKI sú obmedzené na endovaskulárnu alebo angiochirurgickú revaskularizáciu a medikamentóznu liečbu. Až 40 % pacientov však  nie je kandidátom na revaskularizáciu a rovnako, ako aj pacienti, u ktorých revaskularizačná liečba zlyhala, sú odsúdení na medikamentóznu liečbu, ktorá má malú, resp. žiadnu účinnosť, a riziko amputácie i mortalita sa zvyšujú. Preto došlo v ostatných dvoch dekádach k rozvoju nových liečebných stratégií s cieľom podporiť neovaskularizáciu pomocou metód tzv. terapeutickej angiogénézy.

Mechanizmy neovaskularizácie pri obštrukcii artériového systému

V prípade, že dôjde k závažnej stenotizácii alebo obštrukcii artériového systému, predpokladá sa, že dochádza v ľudskom organizme k aktivácii rôznych endogénnych kompenzačných mechanizmov s cieľom zabezpečiť adekvátnu perfúziu ischemického tkaniva (4). Medzi tieto mechanizmy neovaskularizácie patrí arteriogenéza, angiogenéza a vaskulogenéza.

Arteriogenéza predstavuje rozvoj kolaterálneho riečiska  a zväčšenie už existujúcich kolaterál. Tento proces prispieva k  neovaskularizácii v priebehu vývoja, ako aj v dospelosti a vlastne predstavuje proces maturácie a pravdepodobne aj rastu nových kolaterálnych spojok. Tieto kolaterály premosťujú obliterované časti rovnakej alebo inej artérie vytváraním kolaterálneho riečiska. Časom dochádza k adaptácii týchto kolaterál na tlakové zmeny remodeláciou cievnej steny a k akumulácii mononukleárnych buniek. K dozrievaniu kolaterálnych spojok prispieva množstvo rastových faktorov vrátane fibroblastového rastového faktora (fibroblast growth factor, FGF), doštičkového rastového faktora (platelet derived growth factor, PDGF) a vaskulárneho endotelového rastového faktora (vascular endothelial growth factor, VEGF) spolu s chemokínmi (17). Novovzniknuté cievne siete nielen dopĺňajú už existujúce väčšie kolaterálne siete, ale aj vytvárajú nové funkčné spojenia medzi rôznymi cievnymi štruktúrami.

Angiogenéza predstavuje postupné vytváranie nových kapilár z postkapilárnych venúl (formácia kapilár z preexistujúcich cievnych štruktúr), čo zahŕňa aktiváciu endotelových buniek, degradáciu extracelulárneho matrixu, migráciu, proliferáciu, maturáciu a stabilizáciu nových ciev náborom pericytov a hladkých svalových buniek (6). Zdá sa, že angiogenéza závisí od hypoxie, môže sa však vyskytnúť aj v oblastiach s normálnym tlakom kyslíka. Keďže angiogenéza zvyšuje plochu na kapilárnej úrovni, dochádza k zníženiu cievnej rezistencie, zvyšuje sa prietok a tým sa priamo ovplyvňuje tvorba nových kolaterál.

Vaskulogenéza je proces tvorby nových ciev z prekurzorov endotelových buniek (in situ formácia nových ciev). Tieto bunky, odvodené z buniek kostnej drene, tzv. endotelové progenitorové bunky (endothelial progenitor cells, EPC), hrajú kľúčovú úlohu vo fyziologickom i patologickom raste ciev v dospelosti, a to pravdepodobne cestou sekrécie angiogénnych rastových faktorov a zabezpečením dostatočného množstva progenitorových buniek, ktoré môžu cirkulovať a diferencovať sa na zrelé vaskulárne endotelové bunky (21).

Kmeňové bunky v liečbe kritickej končatinovej ischémie

Kmeňové bunky majú schopnosť sa rozdeliť a diferencovať na jeden alebo viaceré bunkové typy (12). Embryonálne kmeňové bunky sú jediným druhom buniek, ktoré majú schopnosť diferenciácie na akýkoľvek typ buniek (tzv. pluripotentné bunky) (15). Tieto sa vyvinú na čiastočne diferencované kmeňové bunky, z ktorých môžu vzniknúť rôzne línie buniek, ale tie sa už nemôžu ďalej vyvinúť na akýkoľvek typ bunky (sú to multipotentné kmeňové bunky). Medzi tento druh buniek patria dospelé kmeňové bunky. Asahara a spoluprac. prvýkrát zistili, že periférna krv obsahuje endotelové progenitorové bunky, ktoré sa môžu plne vyvinúť na plne diferencované a funkčné endotelové bunky (3). Ako už bolo spomenuté, predpokladá sa, že endotelové progenitorové bunky pôsobia jednak pomocou parakrinného efektu so stimuláciou proliferácie usídlených endotelových buniek v cievnej stene pomocou rastových faktorov a cytokínov, na druhej strane ide o navádzanie a priame začlenenie endotelových progenitorových buniek do existujúcich ciev s podporou tvorby nových kolaterál (5, 19). K hlavným faktorom podieľajúcim sa na parakrinnom účinku EPC patrí fibroblastový rastový faktor, doštičkový rastový faktor  a vaskulárny endotelový rastový faktor.

V súčasnosti existuje niekoľko zdrojov progenitorových buniek pri autológnej transplantácii u ľudí, medzi najčastejšie patrí kostná dreň a periférna krv, medzi ďalšie možnosti tukové tkanivo a pupočníková krv. V klinických štúdiách reprezentuje kostná dreň najčastejšie používaný zdroj progenitorových buniek, pravdepodobne z toho dôvodu, že proces získania kostnej drene je pomerne jednoduchý a nie sú potrebné nijaké komplexné kroky purifikácie získaných buniek. Hlavným obmedzením primárnej transplantácie progenitorových buniek z periférnej krvi je ich pomerne malé množstvo v periférnej krvi, preto je potrebné na získanie dostatočného množstva viabilných a funkčných endotelových progenitorových buniek vykonať určité postupy, čo pred­stavuje napr. podporu mobilizácie endotelových progenitorových buniek pomocou stimulácie cytokínmi, resp. rastovými faktormi. Jedným z najatraktívnejších zdrojov izolácie buniek pre terapeutickú angiogenézu by bola ľudská umbilikálna alebo placentárna krv, ale použitie pupočníkovej krvi ako zdroja pre angiogénnu liečbu je stále obmedzené predovšetkým etickými otázkami a potenciálnym nebezpečenstvom pri ich diferenciácii na nežiaduce typy buniek. Ďalším zaujímavým zdrojom pri terapeutickej angiogenéze je autológne subkutánne tukové tkanivo. Jednoduchý chirurgický výkon, jednoduchý a opakovaný prístup k subkutánnemu tukovému tkanivu a nekomplikovaný spôsob izolácie robia toto tkanivo ďalším možným zdrojom kmeňových buniek.

Doteraz bolo publikovaných viacero klinických štúdií liečby kmeňovými bunkami u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou, pričom zväčša sa použili buď mononukleárne bunky získané z kostnej drene, alebo mononukleárne bunky získané aferézou z periférnej krvi po stimulácii alebo bez stimulácie faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov (granulocyty colony-stimulating factor, G-CSF). Prvé výsledky z klinických štúdií pri podaní kmeňových buniek získaných z kostnej drene boli publikované v r. 2002. Tateishi-Yuyama a spoluprac. vykonali randomizovanú kontrolovanú štúdiu u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou (20). Dvadsaťdva pacientov s obojstrannými pokojovými bolesťami alebo nehojacim sa vredom a ABI (ankle-brachial index, členkovo-ramenný index) menej ako 0,6 bolo randomizovaných na intramuskulárne podanie mononukleárnych buniek z kostnej drene ako aktívnej liečby do jednej dolnej končatiny a periférnych mononukleárnych buniek ako placebo do druhej dolnej končatiny. V aktívnej skupine sa zistil signifikantný vzostup transkutánneho tlaku kyslíka (13 [9 až 17], p < 0,0001), zmenšenie pokojových bolestí (–0,85 [–1,6 až –0,12], p = 0,025) a bezbolestného intervalu chôdze po 4 týždňoch od podania buniek (1,2 [0,7 až 1,7], p = 0,0001). Tieto výsledky pretrvali v priebehu 6-mesačného sledovania. Pri použití buniek z periférnej krvi po stimulácii G-CSF Huang a spoluprac. (8) 28 diabetikov s kritickou končatinovou ischémiou randomizovali buď do aktívnej skupiny s ich intramuskulárnym podaním do postihnutej končatiny, alebo do kontrolnej skupiny. Po 3 mesiacoch bolo signifikantné zlepšenie pokojových bolestí ako aj defektov u pacientov v aktívnej skupine. Podobné sľubné výsledky boli publikované aj v ďalších prácach, či už s podaním periférnych buniek, alebo buniek z kostnej drene (2, 10, 11, 16, 18).

Génová liečba kritickej končatinovej ischémie

Medzi hlavné angiogénne rastové faktory, ktoré prispievajú k neovaskularizácii na podklade rozličných mechanizmov, patrí VEGF, FGF, hepatocytový rastový faktor (hepatocyte growth factor, HGF), inzulínu podobný rastový faktor (insulin-like growth factor, IGF), G-CSF, placentárny rastový faktor (placentar growth factor, PGF), angiopoetín 1 (ANG-1), niektoré druhy interleukínov, ako aj určité transkripčné faktory, ako hypoxia inducibilný faktor-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1) (7). Tieto angiogénne látky sa môžu aplikovať buď vo forme rekombinantného proteínu, alebo použitím nevírusových alebo vírusových nosičov na zakódovanie angiogénneho proteínu pomocou génového transferu, pričom samotný génový transfer sa sústreďuje na zavedenie cudzích nukleových kyselín do cieľových buniek s cieľom dosiahnuť lokalizovanú, trvalú terapeutickú nadmernú expresiu vybraného génu. Použitie nemodifikovanej DNA pomocou nevírusových nosičov je jednoduché a dobre tolerované organizmom príjemcu pre nízku toxicitu a nízku imunologickú odpoveď v porovnaní s vírusovými vektormi. Z vírusových vektorov sa najčastejšie používajú adenovírusy, ale môžu sa použiť aj retrovírusy alebo lentivírusy. Okrem zápalovej odpovede na vírusové bielkoviny je najväčšou nevýhodou nepraktickosť opakovania liečby, nakoľko transdukčná efektívnosť je obmedzená na predchádzajúcu expozíciu vírusom.

V I. aj II. fáze klinických štúdií s použitím génovej terapie bolo publikovaných niekoľko sľubných výsledkov. Pri TALISMAN génovom programe (The Therapeutic Angiogenesis Leg Ischemia Study for Management of Arteriopathy and Non-healing ulcers, TALISMAN 201) bola randomizovaná dvojito zaslepená, placebom kontrolovaná multicentrická II. fáza štúdie u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou s vysokým rizikom amputácie. Stodvadsaťpäť pacientov s nehojacimi sa defektmi bez možnosti revaskularizácie bolo randomizovaných na 8 intramuskulárnych podaní 2,5 ml nevírusového rekombinantného plazmidu obsahujúceho gén kódujúci FGF 1 (NV1FGF, non-viral fibroblast growth factor 1) (8 × 2000 ?g) alebo placeba na 1. 15. 30. a 45. deň (opakované podania). Primárnym koncovým bodom bolo úplné zhojenie aspoň jedného defektu po 6 mesiacoch. Sekundárnymi koncovými bodmi boli amputácie a úmrtia v priebehu 1 roku. Percento pacientov so zhojeným aspoň jedným defektom na postihnutej končatine bolo v 25. týždni 19,5 % v NV1FGF skupine a 14,3 % v placebovej skupine. Rozdiel nebol signifikantný (p = 0,514); ale podanie NV1FGF signifikantne znížilo riziko všetkých amputácií (hazard ratio [HR] 0,485, p = 0,013) aj veľkých amputácií (HR 0,371, p = 0,019), spolu so znížením kombinovaného koncového bodu veľkých amputácií a úmrtí (HR 0,435, p = 0,011) v porovnaní s placebom (13).

Záver

Bunková a génová liečba ukázala povzbudivé výsledky pri podpore neovaskularizácie u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou. Vzhľadom na patogenézu procesu tvorby nových ciev sa zdá byť nádejné a logické smerovanie kombinovať bunkovú a génovú liečebnú stratégiu. Presné typy buniek, respektíve ich kombinácia, zodpovedné za efekt bunkovej liečby nie sú stále známe, ale selekcia proangiogénnych typov buniek a filtrácia nechcených a nežiaducich (potenciálne pôsobiacich v prospech aterosklerotického procesu) môžu zlepšiť terapeutickú efektivitu. Aj keď potreba týchto nových revaskularizačných metód u pacientov s KKI bez možnosti endovaskulárnej alebo chirurgickej revaskularizácie je výrazná, možné vedľajšie účinky neovaskularizačnej liečby by sa nemali dostať do úzadia. Preto je potrebné dlhodobé sledovanie všetkých pacientov liečených bunkovou alebo génovou terapiou na získanie jasných dôkazov o dlhodobej bezpečnosti.

Na záver treba opätovne zdôrazniť, že postnatálna neovaskularizácia prostredníctvom bunkovej liečby, génovej liečby rastovými faktormi alebo kombináciou týchto postupov sa javí byť živou terapeutickou alternatívou u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou bez ďalšej možnosti liečby. Definitívne postavenie autológnej transplantácie kmeňovými bunkami, ako aj génovej terapie v liečbe kritickej končatinovej ischémie stanovia v blízkej budúcnosti prebiehajúce randomizované kontrolované štúdie, ktoré by mali odpovedať aj na otázku optimálnej dávky, spôsobu podania prípadnej kombinácie podania endotelových progenitorových buniek a rastových faktorov na dosiahnutie efektívnej a bezpečnej terapeutickej angiogenézy u týchto pacientov.

Táto publikácia bola vytvorená realizáciou projektu Transplantácia autológnych buniek kostnej drene u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou. ITMS kód: 26240220023, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Literatúra

1.    ALBERS, M., FRATEZI, A.C., de LUCCIA, N.: Assessment of quality of life of patients with severe ischemia as a result of infrainguinal arterial occlusive disease. J Vasc Surg, 16, 1992, s. 54-59.
2.    AMMAN, B., LUEDEMANN, C., RATEI, R., SCHMIDT- LUCKE, J.A.: Autologous bone marrow cell transplantation increases leg perfusion and reduces amputations in patients with advanced critical limb ischemia due to peripheral artery disease. Cell Transplant, 18, 2009, s. 371–380.
3.    ASAHARA, T., MUROHARA, T., SULLIVAN, A., SILVER, M., van der ZEE, R., LI, T., WITZENBICHLER, B., SCHATTEMAN, G., ISNER, J.M.: Isolation of curative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science, 275, 1997, s. 964-967.
4.    CARMELIET, P.: Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med, 6, 2000, s. 389-395.
5.    CROSBY, J.R., KAMINSKI, W.E., SCHATTEMAN, G., MARTIN, P.J., RAINES, E.W., SEIFERT, R.A., BOWEN-POPE, D.F.: Endothelial cells of hematopoietic origin make a significant contribution to adult blood vessel formation. Circ Res, 87, 2000, s. 728-730.
6.    D’AMORE, P.A., THOMPSON, R.W.: Mechanisms of angiogenesis. Ann Rev Physiol, 49, 1987, s. 453-464.
7.    HENRY, T.D.: Therapeutic angiogenesis. Br Med J, 318, 1999, s. 1536-1539.
8.    HUANG, P., LI, S., HAN, M., XIAO, Z., YANG, R., HAN, CH.: Autologous transplantation of Granulocyte Colony–Stimulating Factor–mobilized peripheral blood mononuclear cells improves critical limb ischemia in diabetes. Diabetes Care, 28, 2005,  s. 2155-2160.
9.    KAZMERS, A., PERKINS, A.J., JACOBS, L.A.: Major lower extremity amputation in Veterans Affairs medical centers. Ann Vasc Surg, 14, 2000, č. 3, s. 216-222.
10.    KLEPANEC, A., VULEV, I., BALÁZS, T., BAŽÍK, R., MISTRÍK, M., NECPAL, R., TOMKA, J., KOZLOVSKÁ, T., MAĎARIČ, J.: Autológna transplantácia kmeňových buniek u pacienta s kritickou končatinovou ischémiou – 12 mesačné sledovanie. Kazuistika. Slov Radiol, 17, 2010, č. 2, s. 9–12.
11.    LARA-HERNANDEZ, R., LOZANO-VILARDELL, P., BLANES, P., TORREGUITART-MIRADA, N., GALMÉS, A., BESALDUCH, J.: Safety and efficacy of therapeutic angiogenesis as a novel treatment in patients with critical limb ischemia. Ann Vasc Surg, 24, 2010,
s. 287-294.
12.    MURACA, M., GALBIATI, G., VILEI, M.T., COELHO FABRICIO, A.S., CARUSO, M.: The future of stem cells in liver diseases. Ann Hepatol, 5, 2006, s. 68-76.
13.    NIKOL, S., BAUMGARTNER, I., van BELLE, E., DIEHM, C., VISONA, A., CAPOGROSSI, M.C., FERREIRA-MALDENT, N., GALLINO, A., WYATT, M.G., WIJESINGHE, L.D., FUSARI, M., STEPHAN, D., EMMERICH, J., POMPILIO, G., VERMASSEN, F., PHAM, E., GREK, V., COLEMAN M., MEYER, F.: Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia. Mol Ther, 16, 2008, č. 5, s. 808-810.
14.    NORGREN, L., HIATT, W.R., DORMANDY, J.A., NEHLER, M.R., HARRIS, K.A., FOWKES, F.G.; TASC II Working Group, BELL, K., CAPORUSSO, J., DURAND-ZALESKI, I., KOMORI, K., LAMMER, J., LIAPIS, C., NOVO, S., RAZAVI, M., ROBBS, J., SCHAPER, N., SHIGEMATSU, H., SAPOVAL, M., WHITE, C., WHITE, J., CLEMENT, D., CREAGER, M., JAFF, M., MOHLER, E. 3rd., RUTHERFORD, R.B., SHEEHAN, P., SILLESEN, H., ROSENFIELD, K.: Inter-society consensus for the management of peripheral arterial disease (TASC II). Eur J Vasc Endovasc Surg, 33 (Suppl), 2007, s. 1-75.
15.    OERTEL, M., SHAFRITZ, D.A.: Stem cells, cell transplantation and liver repopulation; Biochim Biophys Acta, 1782, 2008, s. 61-74.
16.    PROCHÁZKA, V., GUMULEC, J., JALŮVKA, F., SALOUNOVÁ, D., JONSZTA, T., CZERNÝ, D., KRAJČA, J., URBANEC, R., KLEMENT, P., MARTINEK, J., KLEMENT, G.L.: Cell therapy, a new standard in management of chronic critical limb ischemia and foot ulcer. Cell Transplant, 19, 2010, s. 1413-1424.
17.    SCHAPER, W., SCHOLZ, D.: Factors regulating arteriogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 23, 2003, s. 1143-1151.
18.    TALAPKOVÁ, R., HUDEČEK, J., ŠINÁK, I., KUBISZ, P., HLINKA, Ľ., PATKAŇOVÁ, L., ZELEŇÁK, K., LACA, Ľ.: Autológna transplantácia kmeňových buniek pre záchranu ischemickej končatiny – predbežné výsledky. Vask Med, 2, 2010, č. 2, s. 89-92.
19.    TATENO, K., MINAMINO, T., TOKO, H., AKAZAWA, H., SHIMIZU, N., TAKEDA, S., KUNIEDA, T., MIYAUCHI, H., OYAMA, T., MATSUURA, K., NISHI, J., KOBAYASHI, Y., NAGAI, T., KUWABARA, Y., IWAKURA, Y., NOMURA, F., SAITO, Y., KOMURO, I.: Critical roles of muscle-secreted angiogenic factors in therapeutic neovascularization. Circ Res, 2006, s. 1194-1202.
20.    TATEISHI-YUYAMA, E., MATSUBARA, H., MUROHARA, T., IKEDA, U., SHINTANI, S., MASAKI, H., AMANO, K., KISHIMOTO, Y., YOSHIMOTO, K., AKASHI, H., SHIMADA, K., IWASAKA, T., IMAIZUMI, T.: Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet, 360, 2002, s. 427-435.
21.    TEPPER, O.M., CAPLA, J.M., GALIANO, R.D., CERADINI, D.J., CALLAGHAN, M.J., KLEINMAN, M.E., GURTNER, G.C.: Adult vasculogenesis occurs through in situ recruitment, proliferation, and tubulization of circulating bone marrow-derived cells. Blood, 105, 2005, s. 1068-1077.