• Katarína ZÁVODNÁ, Michal KONEČNÝ a Eva WEISMANOVÁ
• Prínos molekulovej biológie v diagnostike familiárneho medulárneho karcinómu štítnej žľazy
• Lek Obz, 59, 2010, č. 11, s. 453 – 456.

Súhrn

Mnohopočetná endokrinná neoplázia typu 2 (MEN2) patrí medzi zriedkavé choroby, pre ktoré je charakteristický výskyt medulárneho karcinómu štítnej žľazy (MTC), unilaterálneho alebo bilaterálneho feochromocytómu (PHEO) a ďalších hyperplázií alebo neoplázií rôznych endokrinných tkanív. Syndróm MEN2 je spôsobený aktivačnou zárodočnou mutáciou v onkogéne RET, ktorý je lokalizovaný na chromozóme 10q11.2. Uvedený gén kóduje tyrozíno-kinázový transmembránový receptor. Skú­senosti získané z klinickej genetickej praxe a molekulovej biológie pomohli zlepšiť diagnostiku a následne liečbu pacientov. Genetické testovanie umožňuje identifikovať medzi asymptomatickými pokrvnými príbuznými tých jedincov, ktorí majú mutáciu v géne RET. Nositelia patologickej mutácie sú zaradení do preventívnych programov zameraných na včasné zachytenie nádorovej choroby. Objavenie fenotypovo-genotypových korelácií pri syndróme MEN2 umožňuje pristupovať k jednotlivým pacientom individuálne pri plánovaní chirurgického výkonu, ktorý v súčasnosti predstavuje jedinú možnosť kurability choroby.

Kľúčové slová: medulárny karcinóm – syndróm MEN2 – gén RET – molekulovo-genetická analýza génu RET.

Lek Obz, 59, 2010, č. 11, s. 453 – 456.

Molecular genetics contribution to diagnostics of familial medullary thyroid carcinoma

Summary

Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN2) is a rare hereditary complex disorder characterized by the presence of medullary thyroid carcinoma (MTC), unilateral or bilateral pheochromocytoma (PHEO) and other hyperplasia or neoplasia of different endocrine tissues within a single patient. Predisposition to MEN2 is caused by germline activating mutations of the RET oncogene, localised on chromosome 10q11.2. The RET gene encodes a single-pass transmembrane tyrosine kinase that is the receptor for glial-derived neurotrophic growth factors. The combination of clinical and genetic investigations, together with the improved understanding of the molecular and clinical genetics of the syndrome, helps the diagnosis and treatment of patients. Currently, DNA testing makes possible the early detection of asymptomatic gene carriers, allowing identifying and treating the neoplastic lesions at the early stages. In particular, the identification of strong genotype-phenotype correlation in MEN2 syndrome may enable a more individualized treatment for patients, improving their quality of life. At present, surgical treatment offers the only chance of cure and therefore, early genetic and clinical detection and prophylactic surgery in subjects at risk is the main therapeutic goal.

Key words: medullary thyroid carcinoma, MEN2 syndrome, RET gene, genetic molecular RET gene analysis.

Lek Obz, 59, 2010, 11, p. 453 – 456.

Medulárny karcinóm štítnej žľazy

Medulárny karcinóm štítnej žľazy (MTC) patrí medzi zriedkavé typy nádorov štítnej žľazy, predstavuje približne 5 – 10 % tejto malignity. Môže sa vyskytnúť v sporadickej (náhodnej) (75 % prípadov) alebo v dedičnej forme (25 % prípadov). Pri fami­liárnom medulárnom karcinóme štítnej žľazy vzniká najprv hyperplázia C-buniek štítnej žľazy, neskôr mikro­karcinómy a nakoniec klinicky manifestná choroba, pričom čas od vzniku hyperplázie do vzniku nádoru je značne variabilný (v niektorých prípadoch až niekoľko rokov) (8). Typickou črtou medulárnych karcinómov je tendencia tvoriť lokálne aj vzdialenejšie metastázy. Charakteristickým znakom medulárnych karcinómov je tvorba kalcitonínu.

Stručná charakteristika syndrómu MEN2

Syndróm MEN2 možno charakterizovať ako zried­kavú chorobu charakterizovanú kombináciou medulár­neho karcinómu štítnej žľazy, unilaterálneho a bilate­rálneho feochromocytómu (PHEO) a ďalších hyperplázií alebo neoplázií rôznych endokrinných tkanív.

Syndróm MEN2 zahŕňa 3 podtypy: MEN2A, MEN2B a familiárny medulárny karcinóm štítnej žľazy (FMTC). Pre variant MEN2A je charakteristický výskyt medu­lárneho karcinómu štítnej žľazy (MTC), unilaretálneho alebo bilaterálneho feochromocytómu a primárnej hyperparatyreózy. Biochemickú manifestáciu MTC (tvorbu kalcitonínu) možno pozorovať medzi 5. – 25. rokom života. Na podtyp MEN2A pripadá viac ako 60 % všetkých prípadov mnohopočetnej endokrinnej neoplázie typu 2 (MEN2).

Podtyp MEN2B je najagresívnejší typ MEN2, po­dieľa sa asi na 5% všetkých typov prípadov MEN2. Vyznačuje sa skorým nástupom (zvyčajne o 10 rokov skôr ako MEN2A) a výskytom agresívnejšieho MTC a PHEO a mnohých neuromatóz a/alebo difúznych ganglioneuromatóz, ale nie hyperparatyreózou. U pacientov sa zjavujú aj poruchy vývoja tela, deformácie chrbtice a marfanoidný vzhľad. Morbidita a mortalita sú vyššie ako u pacientov s MEN2A. Pri familiárnom medulárnom karcinóme štítnej žľazy (FMTC) je jedinou klinickou črtou vznik medulárneho karcinómuu štítnej žľazy, pričom nádory sú menej agresívne v po­rovnaní s MEN2A a MEN2B a prognóza je vo väčšine prípadov relatívne dobrá (6).

Molekulová genetika syndrómu mnohopočetnej endokrinnej neoplázie typu 2

Z genetického hľadiska možno syndróm MEN2 charakterizovať ako autozómovo dominantne dedičnú chorobu (50% pravdepodobnosť, že dieťa zdedí mu­táciu) s 90% penetranciou (90 % jedincov s mutáciou ochorie). Približne pred dvadsiatimi rokmi sa zistilo, že syndróm MEN2 je spôsobený aktivačnou zárodočnou mutáciou v protoonkogéne RET, ktorý je lokalizovaný na chromozóme 10 (10q12.2) (3, 7). Uvedený gén má 20 exónov, kóduje transmembránový proteín (obr. 1) – tyrozíno-kinázový receptor, ktorý je zložený z extra­celulárnej časti, transmembránovej domény a intra­celu­lárnej časti. Extracelulárnu časť tvoria štyri kadherínové domény, cysteínová doména a väzobné miesto pre kalcium. Intracelulárnu časť tvoria dve tyrozíno-kiná­zové domény, ktoré sa zúčastňujú v aktivácii mnohých bunkových procesov, ako je proliferácia, diferenciácia, bunkový transport. Uvedený proteín je exprimovaný na neuroendokrinných bunkách vrátane parafolikulových C-buniek. Väzba ligandu na receptor RET spôsobí di­merizáciu receptora a aktiváciu tyrozíno-kináz, čím nastáva prenos mitogénneho signálu do bunky.

Onkogénnu aktiváciu proteínu RET spôsobujú záro­dočné mutácie v géne RET, a preto je dôležité práve molekulovogenetické vyšetrenie uvedeného génu. Doterajšie štúdie uvádzajú, že takmer 98 % pacientov s MEN2 je nositeľom zárodočnej mutácie v géne RET, mutácie sú lokalizované preferenčne v exónoch: 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16 (obr. 1) (5). Práve z tohto dôvodu je testovanie zárodočných mutácií zamerané na uvedené exóny. Mutácie lokalizované v tej časti génu, ktorá tvorí extracelulárnu časť proteínu RET (exón 10 a 11), umožňujú dimerizáciu receptora aj bez väzby ligandu a dochádza k trvalej aktivácii tyrozíno-kinázy (trvalá aktivácia receptora). Pokiaľ sú mutácie lokalizované v tyrozíno-kinázovej doméne receptora (najmä exón 15 a 16), indukuje sa fosforylácia alternatívnych substrátov. Možno konštatovať, že zárodočná mutácia v géne RET vedie k trvalej aktivácii receptora, čo spôsobí hyper­pláziu C-buniek a následne ich malígnu transformáciu.

Na základe podrobného sledovania fenotypovo-ge­no­typových korelácií sa určili rôzne skupiny závažnosti mutácií vo vzťahu k vzniku karcinómu. Na podklade uvedených zistení sa vypracovali odporúčania, ako

čo najvhodnejšie načasovať tyreoidektómiu pacientov s presne identifikovanou mutáciou v géne RET (5).

Okrem uvedených mutácií (obr. 1) existujú v géne RET aj ďalšie genetické zmeny, ktoré sa zvyknú označovať ako polymorfizmy. Väčšina polymorfizmov nemá vplyv na funkciu proteínu, avšak nie všetky sú úplne neutrálne. Niektoré polymorfizmy alebo skupina polymorfizmov u jedného jedinca môžu pôsobiť ako genetické modifikátory a môžu byť asociované s urči­tým zvýšeným rizikom vzniku choroby. Zistilo sa, že polymorfizmy v kodóne 691 a 904 génu RET môžu modifikovať vznik nástupu choroby pri syndróme MEN2A (1). Ďalšie štúdie uvádzajú, že niektoré poly­morfizmy boli opísané pri sporadickej forme medu­lárneho karcinómu štítnej žľazy. Ako príklad možno uviesť polymorfizmus IVS1-126G>T , ktorý sa vyskytuje v intróne 1 génu RET, alebo už spomínané polymorfiz­my v kodóne 691 a 904 (2). Polymorfizmus v kodóne 691, ktorý spôsobí zámenu glycínu na serín, sa zvykne označovať ako funkčný polymorfizmus z toho dôvodu, že zámena aminokyselín v proteíne môže vytvoriť nové miesto pre fosforyláciu, čo môže ovplyvniť následnú signalizáciu. Na potvrdenie uvedenej hypotézy sú však potrebné ďalšie štúdie (4).

Za povšimnutie určite stojí aj variant v intróne 14 (IVS14-24G>A), ktorý bol zistený v signifikantne vyššej frekvencii u pacientov so sporadickým MTC. Uvedený variant je lokalizovaný v intróne génu (nekódujúcej časti génu), ale v blízkosti miesta, ktoré môže ovplyvniť zostrih génu. Autori odporúčajú pacientov s uvedeným variantom pozorne monitorovať (1). Na záver treba podotknúť, že napriek tomu, že existujú informácie o význame polymorfizmov a iných variantov pri vzniku MTC a v súčasnosti sú predmetom záujmu mnohých vedeckých štúdií, ešte však uplynie určitý čas, kým sa podarí presne zadefinovať ich jednoznačný význam.

Obrázok 1. RET tyrozíno-kinázový receptor a mutácie asociované s MEN2 syndrómom (podľa 5)
Figure 1. The RET tyrosine kinase receptor and mutations associated with MEN2 syndrome

Molekulovo-genetické vyšetrenie mutácií v géne RET

Dôležitým krokom pre molekulovo-genetické vy­šetrenie mutácií v géne RET je zachytenie pacienta, respektíve rodiny s diagnostikovaným medulárnym karcinómom štítnej žľazy. K zachyteniu pacienta do­chádza zväčša v endokrinologickej ambulancii. Uvedeného jedinca následne endokrinológ odošle na konzultáciu ku klinickému genetikovi. Počas uvedenej konzultácie sa pacientovi poskytnú ďalšie dôležité informácie o možnosti absolvovať molekulovo-genetické vyšetrenie a o význame daného vyšetrenia pre pria­mych pokrvných príbuzných. Po absolvovaní genetickej konzultácie nasleduje molekulovo-genetická analýza mutácií v géne RET.

Detekcia (hľadanie) zárodočnej mutácie v géne RET sa vykonáva v molekulovo-genetickom laboratóriu. Vyšetrenie je náročné na čas, prístrojové vybavenie a kvalifikovaný personál. Na zistenie zárodočnej mutácie je potrebné získať vzorku DNA od jedinca s diagnos­tikovanou nádorovou chorobou. DNA je možné izolovať z rôznych tkanív ľudského tela, najjednoduchšia a naj­častejšie používaná je izolácia z periférnej krvi, presnej­šie z bielych krviniek (leukocytov). V súčasnosti sa na izoláciu DNA z krvi používajú rôzne komerčné sety na báze kolónkovej extrakcie. Po izolácii DNA sa za použitia špeciálnych techník molekulovej biológie „na­množí“ (amplifikuje) úsek DNA (PCR reakcia), v ktorom sa nachádza vyšetrovaný gén (niektorý exón génu RET). Amplifikácia cieľového úseku DNA prebieha v ter­mocykléroch pri rôznych zmenách teploty. Následne sa na automatickom genetickom analyzátore – sekvená­tore určí poradie jednotlivých nukleotidov („písmen“ A, T, G, C) v cieľovom úseku DNA. Stanoví sa teda sekvencia génu, preto sa celá procedúra označuje ako sekvenovanie (obr. 2).

Obrázok 2. Príklad sekvenačnej analýzy, dvojpík v rámiku predsta­vuje zárodočnú mutáciu
Figure 2. An example of sequencing chromatogram, the double peak in the square represents germline mutation

Priame sekvenovanie DNA sa dnes označuje ako zlatý štandard pri určovaní zárodočných mutácií a poly­morfizmov. Spomínaná metóda je v súčasnosti auto­matizovaný proces a nahradila rôzne iné metódy, ktoré sa používali predtým a vyznačovali sa nižšou senzitívnosťou zachytenia mutácie. Nezanedbateľným vplyvom je aj eliminácia subjektívneho hodnotenia vý­sledku. Použitím metódy sekvenovania DNA sa presne určí typ zárodočnej mutácie u pacienta v prípade, ak je spomínaná choroba asociovaná s mutáciou v géne RET. Výsledok molekulovo-genetickej analýzy sa následne interpretuje pacientovi a navrhuje sa ďalší postup. Prvotná identifikácia zárodočnej mutácie u pacienta s nádorovou chorobou umožní vykonávať cielenú iden­tifikáciu dokázanej patologickej mutácie aj u ostatných pokrvných rodinných príbuzných.

Molekulovo-genetické vyšetrenie zamerané na dôkaz prítomnosti mutácie v géne RET umožňuje jednoznačne určiť nosičov, resp. nenosičov mutácie. Jedinci s mutáciou v géne RET sú vystavení zvýšenému riziku vzniku medulárneho karcinómu štítnej žľazy v priebehu života a navrhne sa im tyreoidektómia, zatiaľ čo nenosiči mutácie sú bez zvýšeného rizika vzniku tohto typu nádoru a nie je ich potrebné dispen­zarizovať.

Záver

Možno konštatovať, že rozvoj techník molekulovej biológie a s tým spojené objavenie asociácie génu RET so syndrómom MEN2 priniesli výrazné zmeny v diagnos­tike a následnom manažmente pacientov s dedičnou formou medulárneho karcinómu štítnej žľazy.

Literatúra

1.    Baumgartner-Parzer, S.M., Lang, R., Wagner, L., Heinze, G., Niederle, B., Kaserer, K., Waldhausl, W., Vierhapper, H.: Polymorphisms in exon 13 and intron 14 of the RET proto-oncogene: genetic modifiers of medullary thyroid carcinoma? J Clin Endocr Metab, 90, 2005, s. 6232–6236.
2.    CEBRIAN, A., LESUEUR, F., MARTIN, S., LEYLAND, J., AHMED, S., LUCCARINI, C., SMITH, P.L., LUBEN, R., WHITTAKER, J., PHAROAH, P.D., DUNNING, A.M., PONDER, B.A.: Polymorphisms in the initiators of RET (rearranged during transfection) signaling pathway and susceptibility to sporadic medullary thyroid carcinoma. J Clin Endocr Metab, 90, 2005, s. 6268–6274.
3.    Donis-Keller, H., Dous, S., Chi, D., Carlson, K.M., Toshima, K., Lairmore, T.C., Howe, J.R., Moley, J.F., Goodfellow, P., Wells, S.A.: Mutations in RET proto-oncogene are associated with MEN 2A and FMTC. Hum Mol Genet, 2, 1993, s. 851-856.
4.    Fitze, G., Schierz, M., Kuhlisch, E., Schreiber, M., Ziegler, A., Roesner, D., Schackert, H.K.: Novel intronic polymorphisms in the RET proto-oncogene and their association with Hirschsprung disease. Hum Mutat, 22, 2003, s. 177.
5.    Machens, A., Dralle, H.: Genotype-phenotype based surgical concept of hereditary medullary thyroid carcinoma. World J Surg, 31, 2007, s. 957-968.
6.    Marini, F., Falchetti, A., del Monte, F., Sala, S.C., Tognrini, I., Luzi, E., Brandi, M.L.: Multiple endocrine neoplasia type 2. Orphanet J Rare Dis, 45, 2006, č. 1, s. 6.
7.    Mulligan, L.M., Kwok, J., Healey, C.S., Elsdon, M.J., Eng, C., Gardner, E., Love, D.R., Mole, S.E., Moore, J.K., Papi, L.: Germ-line mutations of the RET proto-oncogene in multiplne endocrine neoplasia type 2A. Nature, 363, 1993, s. 458-460.
8.    Papotti, M., Botto Micca, F., Favero, A., Palestini, N., Bussolati, G.: Poorly differentiated thyroid carcinomas with primordial cell component. A group of aggressive lesions sharing insular, trabecular, and solid patterns. Am J Surg Pathol, 17, 1993, s. 291-301.

Katarína ZÁVODNÁ, Michal KONEČNÝ a Eva WEISMANOVÁ
(Z Oddelenia lekárskej genetiky Ústavu laboratórnych a vyšetrovacích metód Onkologického ústavu sv. Alžbety,  Bratislava, vedúci RNDr. M. Konečný, PhD.)